Autor: sheila.camacho

PASTE, nueva técnica basada en CRISPR, expande la edición genómica

Investigadores del Instituto de Tecnología de Massachusetts han desarrollado PASTE, una nueva herramienta CRISPR, que permite insertar fragmentos de ADN de gran tamaño en posiciones específicas.

Pero primero, ¿En que consiste la herramienta CRISPR?

El sistema CRISPR-Cas9 clásico se basa en la utilización de una enzima Cas9 la cual corta ambas cadenas del ADN, y un ARN guía que posiciona a la enzima en el lugar especifico donde se quiere realizar el corte. Esta aproximación es muy útil cuando lo que se desea es inactivar un gen. Un inconveniente de Cas9 es que introduce un punto de rotura en el ADN que debe ser reparado por los mecanismos de reparación de la célula. Estos no son infalibles y durante el proceso se eliminan algunos nucleótidos, lo que puede llevar a inactivar el gen afectado. Otra posibilidad es añadir un ADN que actúe como molde para los mecanismos de reparación, en cuyo caso se puede corregir un error genético.

Figura 1: Mecanismo del sistema CRISPR-CAS9

Mediante la herramienta PASTE (de Adición Programable vía Elementos Diana Específicos de sitio, en sus siglas en inglés) se facilita la introducción de secuencias de hasta 36 kilobases (grandes fragmentos de ADN) en el genoma sin generar puntos de rotura en las dos cadenas de ADN. Una ventaja frente al CRISPR clásico es que puede ser utilizado en celulas en división y genera menos modificaciones en posiciones no deseadas.

De tal forma que se hace posible reemplazar genes ya que hasta el momento, la mayor parte de herramientas de edición estaban dirigidas a la inactivación de genes o corrección de mutaciones.

Una de las principales ventajas de esta herramienta es el corte e solo una cadena. Para ello utilizaron una enzima Cas9 (combinada con un ARN guía) que en lugar de cortar las dos cadenas del ADN solo corta una . Además se requería que tuviera la capacidad de cambiar un gen defectuoso por uno funcional, para ello recurrieron a un tipo de enzima que utilizan los virus para integrar su genoma en el de las bacterias: las serina integrasas.

Las serinas integrasas se encargan de reconocer secuencias especificas del genoma y facilitar la integración del ADN del virus. En la naturaleza hay más de 25.000 serina integrasas y por tanto con su correspondiente secuencia de destino. De tal forma que durante PASTE se detecta cual sería la combinación de serina integrasa y su respectiva secuencia de reconocimiento para poder editar el genoma.

Una vez obtenida la secuencia especifica necesaria, tiene que haber un elemento que la introdujera para las integrasas. Se utilizó una transcriptasa inversa o retrotranscriptasa unida a un fragmento de ARN complementario de esa respectiva secuencia.

Figura 2: Mecanismo de actuación: en primer lugar el ARN guía posiciona a Cas9 sobre la región de interés. Cas9 introduce un corte en una de las cadenas de ADN y a continuación, la enzima transcriptasa inversa, con ayuda del segundo ARN genera en ese punto una secuencia diana de integración para la serina integrasa. Finalmente, la serina integrasa introduce el fragmento de ADN que carga en el sitio de integración.

En cuanto a sus posibles usos, es una herramienta de gran interés en el reemplazamiento de genes defectuosos en la fibrosis quística, podría facilitar la inserción de genes de interés en terapias celulares…

Actualmente se están buscando nuevas formas de optimizar PASTE y evaluar su potencial en la investigación relacionada con las enfermedades genéticas.

BIBLIOGRAFÍA