Autor: albaoliva.

Evolución dirigida de recombinasas y su uso en integración dirigida de genes en mamíferos

La evolución dirigida es una técnica de gran interés que se está empleando en numerosos ámbitos. como por ejemplo en el desarrollo de nuevas terapias. Consiste en imitar a la selección natural en el laboratorio a fin de obtener variantes evolucionadas de diversas proteínas. Se generan diversas variantes mutadas de una proteína y se seleccionan las que funcionan más adecuadamente para nuestros propósitos, gracias al desarrollo constante de numerosas generaciones en las que se induce la mutación, para imitar el proceso de la evolución y obtener versiones mejoradas de las proteínas que nos interesan.


En este caso se emplea para mejorar la integración dirigida de genes en genomas de mamíferos, que a menudo no es lo suficientemente eficaz o específica. Los investigadores se centraron en mejorar la edición genética mediante integrasas específicas de sitio asistida por edición prime (PASSIGE), queriendo integrar genes completos y funcionales en sus loci endógenos, lo cual supondría un gran avance para la terapia génica.


Es una técnica que permite integrar grandes fragmentos de ADN en sitios específicos del genoma, usando “prime editing” y recombinasas de serina específicas de sitio. Primero se instala un sitio de anclaje para la recombinasa en la ubicación genómica que sea nuestra diana para que la recombinasa pueda entonces catalizar la inserción del ADN en dicho sitio, requiriendo una o dos transfecciones sucesivas.


En concreto “prime editing” consiste en un editor prime o PE con una Cas9 nickasa, una modificación de Cas9 que corta sólo una hebra del ADN, fusionada a una transcriptasa inversa, y con un pegRNA, una guía de ARN, que contiene la secuencia guía que dirige a Cas9 al sitio específico de ADN que se quiere editar, y una extensión que contiene la modificación deseada sirviendo como molde para la transcriptasa inversa. Así se consigue la modificación dirigida sobre la que actuará la recombinasa para introducir el ADN.


A fin de mejorar este sistema, se empleó evolución continua asistida por fagos o PACE para mejorar la actividad de la recombinasa Bxb1. Se quiere conseguir la evolución rápida de la proteína para obtener nuevas variantes más efectivas, obteniendo en este caso evo Bxb1 y eeBxb1, variantes evolucionadas y con mayor eficiencia en la integración del ADN comparadas con la enzima silvestre, debido a mejoras en la estabilidad de la enzima, catálisis y unión al sitio de inserción.

En concreto el sistema es el siguiente, un gen que codifica una proteína esencial para la replicación del fago, en este caso pIII, es reemplazado por el gen de la proteína que se desea evolucionar, en este caso la recombinasa. Este fago modificado se emplea para infectar bacterias a las que se les ha introducido un plásmido P1 con el promotor del gen pIII y un plásmido P2 con el gen pIII sin promotor, de manera que se requiere a la recombinasa para integrar ambos plásmidos y conseguir la expresión del gen necesario para la replicación y propagación de los fagos. Así, sólo aquellos fagos con la recombinasa funcional podrán replicarse y propagarse garantizando que sólo aquellos con variantes activas sobrevivan durante la evolución.

*Descripción general de PACE.

Esta evolución dirigida puede suponer grandes cambios en la investigación y en nuevas terapias como se puede apreciar en este estudio.

Referencias:

Esvelt KM, Carlson JC, Liu DR. A system for the continuous directed evolution of biomolecules. Nature. 2011 Apr 28;472(7344):499-503. doi: 10.1038/nature09929. 

Pandey S, Gao XD, Krasnow NA, McElroy A, Tao YA, Duby JE, Steinbeck BJ, McCreary J, Pierce SE, Tolar J, Meissner TB, Chaikof EL, Osborn MJ, Liu DR. Efficient site-specific integration of large genes in mammalian cells via continuously evolved recombinases and prime editing. Nat Biomed Eng. 2025 Jan;9(1):22-39. doi: 10.1038/s41551-024-01227-1.

Edición genética del ADNmt en el estudio de enfermedades mitocondriales

Investigadores utilizan la edición genética mitocondrial para modelar trastornos genéticos en ratones

Las mitocondrias cuentan con su propio ADN, al que denominamos ADNmt, que lleva a cabo funciones esenciales para la respiración celular y el consumo de energía, por lo que las mutaciones en el ADNmt pueden provocar enfermedades graves. 

Hasta el momento no se sabe demasiado sobre los trastornos genéticos mitocondriales ya que no abundan los modelos animales adecuados con mutaciones específicas del ADNmt. Esto se debe a que la modificación del ADN mitocondrial está limitada por su difícil acceso, que impide emplear herramientas de edición como Cas9.

Sin embargo, en un estudio dirigido por el Dr. Hyunji Lee, profesor del Departamento de Ciencias Biomédicas de la Facultad de Medicina de la Universidad de Corea, empleando una herramienta especializada de edición de ADN, se indujo una mutación en el gen mitocondrial ND5 introduciendo un codón de terminación prematuro. En concreto se empleó el editor de bases de citosina derivado de DddA, que convierte los pares de bases citosina-guanina en timina-adenina, introduciendo una mutación en el ADN mitocondrial.

Esta mutación, inducida en ratones, interrumpe la síntesis proteica, dando una proteína no funcional que afectará a las funciones mitocondriales a nivel del complejo I de la cadena de transporte de electrones, que se compone de  siete polipéptidos (MT-ND1, MT-ND2, MT-ND3, MT-ND4, MT-ND4L, MT-ND5, and MT-ND6), entre los que se encuentra ND5.

Lo esencial de esta investigación es que no sólo se modificó con éxito el gen ND5 del ADNmt, sino que se realizó una exhaustiva evaluación fenotípica, revelando los siguientes datos.

Al perder la funcionalidad del gen ND5 las mitocondrias reducen la expresión del complejo I y por ende los niveles de ATP producidos. Esto lleva a deformaciones en las crestas mitocondriales especialmente a nivel de la corteza cerebral, junto a atrofia y asimetría del hipocampo. 

Además de esto, se observa obesidad por la relación entre las mitocondrias y el metabolismo lipídico, junto a termogénesis reducida.

Las evaluaciones del comportamiento muestran anomalías a nivel del aprendizaje y memoria, que se identificaron por movimientos más lentos e incapacidad para reconocer el miedo.

Fig 1. Mutación del gen MT-ND5, sus efectos en las mitocondrias y fenotipos resultantes.

Este estudio demuestra que es posible y necesario investigar más a fondo sobre los genes mitocondriales a fin de entender los trastornos relacionados con el ADNmt y desarrollar terapias adecuadas para las mismas.

Fuentes

Comprehensive phenotypic assessment of nonsense mutations in mitochondrial ND5 in mice.

Kim, S., Park, S.G., Kim, J. et al. Comprehensive phenotypic assessment of nonsense mutations in mitochondrial ND5 in mice. Exp Mol Med 56, 2395–2408 (2024). https://doi.org/10.1038/s12276-024-01333-9